طرق الهندسة الوراثية

We are searching data for your request:

Forums and discussions:

Manuals and reference books:

Data from registers:

Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

بروتوكول العمل: تحويل بكتريا قولونية

من جديد بكتريا قولونية- الاستزراع بين عشية وضحاها ، يتم إنتاج الخلايا المختصة وفقًا لبروتوكول إنتاج الخلايا المختصة وتخزينها في الجليد حتى استخدامها مرة أخرى للتحول.

بدلاً من ذلك ، في -70 $درجة مئوية$ يتم استخدام الخلايا المختصة المجمدة ، والتي يتم إذابتها بعناية على الجليد. عن طريق إضافة الجلسرين (4 $مل$ الخلايا ، 1 $مل$ 75٪ من الجلسرين) والتجميد في النيتروجين السائل ، يمكن تخزين الخلايا المختصة لعدة أسابيع. ومع ذلك ، فإن الكفاءة التي يمكن أن تمتص بها هذه الخلايا المخزنة الحمض النووي تتناقص بمرور الوقت.

تفاعل الليجاز

يتم إعداد تفاعلين من ligase وتفاعل تحكم على النحو التالي:

علامة التبويب .1: نهج Ligase (الحجم الكلي 20 ميكرولتر لكل منهما ؛ طريقتان)

قطعة أرض	مادة مضافة
2 ميكرولتر	ناقل الحمض النووي: pHK255 - 2،516 نقطة أساس سابقة بمعنى البيئةRI- BgII
3 ميكرولتر	أدخل الحمض النووي: pHK255 - 1،237 نقطة أساس سابقة بمعنى البيئةRI- BgII
2 ميكرولتر	عازلة Ligase ، 10x (500 مم تريس $الرقم الهيدروجيني$ 7.6 ؛ 100 ملي مجكل₂؛ 10 مم DTT ، 10 مم ATP ، 5٪ PEG-5000)
12 ميكرولتر	العطاء. ماء

علامة التبويب 2: دفعة تحكم بدون إدخال DNA (إجمالي الدفعة 20 ميكرولتر)

قطعة أرض	مادة مضافة
2 ميكرولتر	ناقل الحمض النووي pHK255
2 ميكرولتر	عازلة Ligase ، 10x (500 مم تريس $الرقم الهيدروجيني$ 7.6 ؛ 100 ملي مجكل₂؛ 10 مم DTT ، 10 مم ATP ، 5٪ PEG-5000)
15 ميكرولتر	العطاء. ماء

يتم خلط الدُفعات جيدًا ، في كل مرة يُضاف فيها 1 ميكرولتر T4 DNA ligase ويُترك الخليط لمدة 3 تقريبًا. $ح$ المحتضنة في ظل الشروط التالية:

نهج Ligase 1: 4 $درجة مئوية$ ثلاجة
نهج Ligase 2:16 $درجة مئوية$ حمام مائي ، معمل بارد
نهج Ligase 3: التحكم ، 37 $درجة مئوية$ حمام مائي ، تدريب

تحول بكتريا قولونية مع نهج ligase

يضاف 20 ميكرولتر من مخاليط الليجاز إلى كل 100 ميكرولتر من الخلايا المختصة. بالإضافة إلى ذلك ، تم إعداد تحولي تحكم: 100 ميكرولتر خلية مختصة + 1 ميكرولتر بيديست. تمت إضافة الماء (تحكم سلبي لتحديد معدل المقاومة التلقائية) أو 100 ميكرولتر من الخلايا المختصة + 1 ميكرولتر من pHK255 DNA الدائري (تحكم إيجابي لتحديد جودة الخلايا المختصة). يتم خلط جميع الدُفعات الست بلطف ، مما يترك 15 $دقيقة$ على الجليد ، ثم 5 $دقيقة$ في 37 $درجة مئوية$ ، مرة أخرى 10 $دقيقة$ على الجليد ، 5 $دقيقة$ في 37 $درجة مئوية$ ومرة أخرى 15 $دقيقة$ على الجليد. يسمح هذا العلاج اللطيف بالحرارة / البرودة بامتصاص الحمض النووي في الخلايا في طريقة الربط.

أربعة أنابيب ثقافة كل منها مع 0.5 $مل$ متوسطة LB مملوءة (RT). بعد الانتهاء من المعالجة بالحرارة / البرودة ، تتم إضافة مخاليط التحويل الأربعة بشكل كمي قدر الإمكان إلى وسط LB المحضر ، والذي يستخدم بعد ذلك لـ 45 $دقيقة$ في 37 $درجة مئوية$ يتم الاحتفاظ بها في حاضنة الاهتزاز. عن طريق تخفيف محلول كلوريد الكالسيوم بالوسيط ، يمكن الآن أن تغلق الأغشية مرة أخرى. بعد مرحلة التجديد هذه ، يتم طلاء 50 ميكرولتر و 100 ميكرولتر و 200 ميكرولتر من خليط التحويل على ألواح أجار تحتوي على الأمبيسلين ؛ يتم التعامل مع التحكم الإيجابي وفقًا لذلك. يتم طرد خلايا التحكم السلبي ، وتعليقها في الجزر ووضعها بالكامل على لوحة أجار.

تُترك اللوحات طوال الليل عند 37 $درجة مئوية$ المحتضنة في الحاضنة.

تقييم التحول

يمكن تحديد عدد الخلايا المحولة لكل مل عن طريق حساب المستعمرات على الصفيحة. يعطي التحكم الإيجابي مؤشرًا على مدى كفاءة امتصاص الحمض النووي للبكتيريا المختصة المستخدمة في هذه التجربة - وهي نقطة مهمة بشكل خاص عند استخدام خلايا مختصة مخزنة لفترة طويلة. تسمح المقارنة بين تحول خليط الليجاز مع الضبط الإيجابي باستخلاص استنتاجات حول الظروف التجريبية للربط ، مثل نسبة الناقل / الإدراج أو كفاءة معالجة اللايجاز.

من ناحية أخرى ، يُظهر التحكم السلبي ما إذا كان المضاد الحيوي فعالًا وما إذا كانت هناك مقاومة تلقائية. من الناحية المثالية ، يجب أن تكون لوحة أجار التحكم السلبي خالية من المستعمرات.

تحليل البلازميدات

يتم اختيار مستعمرتين عشوائيًا من كل لوحة ووضعهما في 2 $مل$ تلقيح من وسط LB. تزرع هذه الثقافات بين عشية وضحاها في 37 $درجة مئوية$ محتضنة في شاكر. يتم عزل DNA البلازميد لهذه الحيوانات المستنسخة في اليوم التالي باستخدام طريقة minilysate (انظر عزل DNA البلازميد)

يشتمل توصيف البلازميدات (منتجات الليغاز) دائمًا على ثلاثة انشقاقات: الانقسام الخلفي ، والانقسام الشامل والموجه. يتم استخدام الحمض النووي من المستعمرات الست مع سابقة بمعنى البيئةRI وBgلقد انقسمت للخلف بشكل فردي ومجتمعي ، أي يتم فحص الأقسام الأولية للتأكد من التجديد الصحيح. للتأكد من أن الإدخال قد تم ربطه مرة واحدة فقط في المتجه ، الإنزيم يتركيتم استخدام EII ، والذي يسمح بالتحويل الخطي لمكون المتجه. يمكن حذف الانقسام الموجه هنا ، حيث تم استخدام طرفين مختلفين.

إذن هناك ثلاثة إنزيمات متاحة: سابقة بمعنى البيئةRI و Bgأنا في 37 $درجة مئوية$ ; يتركEII في 60 $درجة مئوية$ .

وفقًا للجدول الإضافي الموضح أدناه لتوصيف pHK255 ، يتم تزويد أوعية التفاعل باسم البلازميد وإنزيم التقييد لأربع دفعات انشقاق (ثلاث انقسام فردي وواحد مزدوج). يجب أيضًا مراعاة التحكم والمعيار.

علامة التبويب 3: طريقة التقسيم (الحجم الكلي 20 ميكرولتر):

قطعة أرض	مقاربة
12 ميكرولتر	العطاء. ح₂ا
2 ميكرولتر	10 × NE عازلة 3 (في الحجم الإجمالي وبالتالي 1 ×)
5 ميكرولتر	DNA البلازميد من minilysate الخاص بك
1 ميكرولتر	كل إنزيم تقييد

ثم لنحو 1.5 $ح$ في 37 $درجة مئوية$ أو في 60 $درجة مئوية$ متبوعًا بـ 5 $دقيقة$ في 60 $درجة مئوية$ محتضنة. يمكن أن يحدث تعطيل الحرارة للإنزيم يتركEII لا ينطبق.

قبل الرحلان الكهربائي للهلام الاغاروز ، يضاف 4 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحميل لكل دفعة ويتم ضخ الدفعة في جيب الهلام.